NY_T 2287-2012 水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.66 |
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13 |
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日期： |
2024-8-13 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和农业行业标准,NY/T 2287—2012,水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法,Detection and identification for Xanthomonas oryzae pv.,ozyzicoZa(Fang et al.)Swings et al.,2012-12 - 24 发布2013-03-01 实施,中华人民共和国农业部 发布,NY/T 2287—2012,刖 吉,本标准按照GB 1.!给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出,本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)归ロ,本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、江苏省植物保护站、南京农业大学,本标准主要起草人:王福祥、龚伟荣、胡白石、刘慧、褚姝频、李潇楠、胡婕、朱莉,I,NY/T 2287—2012,水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法,1范围,本标准规定了农业植物检疫中水稻细菌性条斑病菌检测鉴定的技术方法,本标准适用于水稻细菌性条斑病的检测鉴定,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法,GB 8371—2009水稻种子产地检疫规程,GB 15569—2009农业植物调运检疫规程,3原理,水稻细菌性条斑病是为害水稻的重要细菌病害,属国内植物检疫性有害生物。水稻细菌性条斑病,菌的田间症状、菌落形态特征、致病性测试、血清学反应和PCR反应等特征是检测与鉴定的重要依据,4试剂与材料,无水磷酸氢二钠(Na? HPO4 )、无水磷酸氢二钾(K2 HPO4)、无水磷酸二氢钾(KHz PCX )、碳酸钠,(Na2co3)、碳酸氢钠(NaHCC)3 )、氯化钠(NaCD、氯化钾(KC1)、氯化镁(MgCl2 )、无水亚硫酸钠,(NazSOs)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、碘化钾(KD、七水硫酸镁(MgSC)4 ?740)'叠氮化钠,(NaN)、草酸镂［(NHQzQOノ、对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、无菌水、乙醇、市售抗体、市售酶标抗体、市,售PCR试剂等。检验中所需的其他试剂与培养基,参见附录A,除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格,5仪器及用具,超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、生物显微镜、体式显微镜、小型粉,碎机、高速台式离心机、酶标仪、电泳仪、紫外分光光度计、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰,箱、超纯水器或纯水器、恒温干燥箱、微量移液器等,6取样方法,6.1 叶片取样,田间发现水稻细菌性条斑病典型或疑似症状的叶片时(见附录B),直接采样检验,6.2 种子取样,对调运中的种子,按照GB 15569—2009中6. 2的要求抽样,7检验鉴定,7. I症状识别,在水稻生长期按照GB 8371—2009中8.1的要求进行田间调查,与水稻细菌性条斑病为害的典型,症状进行比较(见附录B),符合典型症状的可进行症状鉴定。如发现疑似症状,可采用常规鉴定、,NY/T 2287—2012,ELISA检测以及PCR检测,7.2常规鉴定,7. 2. 1菌溢检查,切取田间采回的植株叶片病健交界处约20 mm2,平放在载玻片的水滴中,加盖玻片后,在低倍显微,镜下观察并记录有无喷菌现象,7. 2.2分离培养,在无菌条件下选取疑似症状叶片病健交界处组织约（3 mm.5 mm） X （3 mm.5 mm）,用75%乙醇,表面消毒15 s,无菌水清洗2次~3次后放入0. 2 mL无菌水中,用灭菌玻璃棒研碎,在室温下浸泡!0,min.30 min。将悬浮液在NBY培养基平板上划线,重复3个.5个平板,（27士2）℃培养3 d.5 d,观,察并记录病原菌形态特征和培养特性（见附录B）,7. 2.3革兰氏鉴定,挑取少量分离到的病原菌配制成悬浮液,进行革兰氏染色法染色或3%KOH溶解试验（参见附录,C）,观察记录病菌的形状、大小和染色反应,7. 2.4致病性鉴定,将分离培养得到的纯培养菌株,用无菌水配制细菌悬浮液（10%fu/mL）,用无菌接种针针刺接种于,感病水稻品种叶片中部,每张叶片针刺2个点.3个点,每株接种2片叶.3片叶,接种!0株。接种植,株套袋保湿24 h,12 h光照/黑暗的循环条件下30℃培养,接种48 h.72 h后观察并记录水稻植株发病,情况,7. 3 ELISA 检测,水稻细菌性条斑病ELISA检测程序参见附录D。如采用市售的试剂盒,按说明操作,7. 4 PCR检测,水稻细菌性条斑病常规PCR检测程序参见附录E。如采用市售的试剂盒,按说明操作,8结果判定和报告,8. I结果判定,8.1. I症状识别判定,田间植株发病症状符合附录B描述的水稻细菌性条斑病典型症状,判断为水稻细菌性条斑病,8. 1.2常规鉴定结果判定,镜检有菌溢现象,分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录,B）,革兰氏染色阴性,致病性鉴定产生典型症状,确定病原菌为水稻细菌性条斑病菌,8. 1.3 ELISA检测结果判定,在阴性对照OD值W。. 1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下,样品孔OD值大于,阴性对照OD值2倍时,判定为阳性反应,即样品带水稻细菌性条斑病菌;否则判定为阴性反应,即样品,不带水稻细菌性条斑病菌,8. 1.4 PCR检测结果判定,观察电泳结果,阳性……
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